PCR-Amplifikationssimulator

Beobachte, wie sich DNA-Kopien durch PCR-Zyklen exponentiell vervielfachen, und finde den Ct-Schwellenzyklus.

Rechenbeispiel — PCR-Amplifikationssimulator

Endkopien	1.07 × 10⁹
Amplifikationsfaktor	1.07 × 10⁹×
Ct	27
Formel	1 × (1+1)n

Das sind die Werte, die der Rechner beim Öffnen der Seite anzeigt. Ändere oben eine Eingabe, um sie neu zu berechnen.

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C_t macht aus Multiplikation eine Subtraktion

Die senkrechte Achse des Diagramms ist logarithmisch, also zeichnet die reine Exponentialfunktion dieses Werkzeugs eine Gerade – und genau das macht die C_t-Anzeige überhaupt brauchbar. C_t ist der Zyklus, in dem die Kurve deine Schwelle überschreitet; eine Vervielfachung des Ausgangsmaterials verschiebt die ganze Gerade daher seitwärts, ohne ihre Steigung zu ändern. Jede Verzehnfachung von C₀ verschiebt C_t um ln 10 / ln(1+e) Zyklen: 3,32 bei perfekter Effizienz, 3,59 bei e = 0,9. Lade die klinische Voreinstellung und gehe mit C₀ von 10 über 100 auf 1000 – C_t fällt auf 18, 15, 11. Aus dieser Verschiebung die Konzentration zurückzurechnen, ist die ganze Grundlage der quantitativen PCR.

Nicht ganz Verdopplung pro Zyklus

PCR arbeitet wie ein molekularer Fotokopierer: Jeder Zyklus versucht, jeden DNA-Strang im Reaktionsgefäß zu verdoppeln. Kein Enzym kopiert jedoch jede Vorlage perfekt, daher legt die Effizienz e den echten Faktor pro Zyklus fest: (1 + e) — 2.0 bei perfekter Effizienz, vielleicht 1.9 bei 90%. Senke die Effizienz im Tool und beobachte, wie dieser kleine Rückstand pro Runde anwächst: Über 30 Zyklen wird aus der Lücke zwischen 1.9× und 2.0× ein Verlust von Millionen Kopien.

Warum PCR eine Yellowstone-Mikrobe brauchte

Jeder Zyklus erhitzt das Gefäß auf etwa 95°C, um die beiden DNA-Stränge zu trennen — heiß genug, um eine gewöhnliche Polymerase zu zerstören. Frühe PCR war mühsam: Techniker pipettierten nach jedem einzelnen Zyklus von Hand frisches Enzym nach. Die Rettung kam von Thermus aquaticus, einem Bakterium aus Yellowstones fast kochenden Quellen, dessen Taq-Polymerase die Hitze übersteht — so läuft die gesamte Reaktion unangetastet in einem Gerät.

Aufgabe vollständig gelöst

Dreißig PCR-Zyklen mit perfekter Effizienz, die ein Molekül in eine Milliarde verwandeln 5 Schritte
Dreißig PCR-Zyklen bei perfekter Effizienz machen aus einem Molekül eine Milliarde. Leite das ab und ermittle dann, was ein Effizienzverlust von 5 % kostet — die Antwort lautet nicht 5 %.
1. Jeder Zyklus kopiert jeden vorhandenen Strang, sodass sich die Population mit 1 + e vervielfacht. Perfekte Effizienz bedeutet e = 1 und eine reine Verdopplung.
  
  $C_n=C_0(1+e)^{n}=1\times2^{30}=1.07\times10^{9}$
2. Dreißig Verdopplungen ergeben 2³⁰, etwa 1,07 Milliarden, aus einem einzigen Ausgangsmolekül. Das ist der eigentliche Grund, warum PCR funktioniert: Eine Menge, die zu klein ist, um nachgewiesen zu werden, wird an einem Nachmittag so groß, dass man sie nicht mehr übersehen kann.
3. Der Schwellenwert-Zyklus kehrt dieselbe Beziehung um — der Zyklus, in dem die Anzahl erstmals eine Nachweisgrenze überschreitet. Es handelt sich um einen Logarithmus, weshalb C_t-Werte durch Subtraktion verglichen werden und ein Zyklus einen Faktor von zwei bedeutet.
  
  $C_0(1+e)^{C_t}=10^{8}\ \Longrightarrow\ C_t=\log_2 10^{8}=26.58\ \rightarrow\ 27$
4. Senkt man nun die Effizienz auf 0,95, vervielfacht sich jeder Zyklus mit 1,95 statt mit 2. Nach dreißig Zyklen sind das 5,02 × 10⁸.
  
  $e=0.95:\quad 1.95^{30}=5.02\times10^{8}$
5. Das Verhältnis beträgt (2/1,95)³⁰ — ein Defizit von 2,5 % pro Zyklus, das sich dreißigmal potenziert.
  
  $\frac{2^{30}}{1.95^{30}}=\left(\frac{2}{1.95}\right)^{30}=2.14$
Antwort

Das Werkzeug gibt 1,07 × 10⁹ Kopien und C_t = 27 aus. Ein Effizienzverlust von 5 % kostet einen Faktor von 2,14, mehr als die Hälfte des Ertrags, da der Verlust dreißigmal vervielfacht und nicht einmal addiert wird. Das ist die zentrale Schwierigkeit der quantitativen PCR: Der Messwert verläuft exponentiell zu einer Größe — der Effizienz —, die von Reaktion zu Reaktion mit dem Primer-Design, der Reinheit der Matrize und der thermischen Gleichmäßigkeit des Geräts variiert. Deshalb wird die qPCR immer gegenüber einer Standardkurve durchgeführt, anstatt ihr als absoluter Zählwert zu vertrauen, und deshalb kann ein einzelner Inhibitor in der Probe genau wie weniger Ausgangsmaterial aussehen.

$C_n=C_0(1+e)^n:\quad e=1\Rightarrow1.07\times10^{9},\ \ e=0.95\Rightarrow 2.14\times\ \text{fewer}$

Quellen (3)

Cₜ, amplification efficiency and how the two are reported: S. A. Bustin et al., "The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments." Clinical Chemistry 55(4), 611–622, 2009.
The real-time kinetic measurement the Cₜ readout models: R. Higuchi, C. Fockler, G. Dollinger and R. Watson, "Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions." Nature Biotechnology 11(9), 1026–1030, 1993.
The thermostable polymerase named in the third block: R. K. Saiki et al., "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase." Science 239(4839), 487–491, 1988.

Vom 7-Raven-Room-Team · Anhand veröffentlichter Quellen geprüft. Korrekturen willkommen.

PCR-Amplifikationssimulator

Ct macht aus Multiplikation eine Subtraktion 🖖

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C_t macht aus Multiplikation eine Subtraktion

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