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A Lei de Beer-Lambert

Defina uma absortividade molar, uma concentração e uma cuvete. O primeiro gráfico acompanha o feixe através da célula e o segundo indica a fiabilidade da leitura obtida.

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A primeira unidade de absorbância custa 90% da luz. A segunda custa 9%.

Introduza 160,77 na concentração, com ε a 6.220 e uma célula de 1 cm. A absorbância marca 1,0000 e 10,00% do feixe atravessa a amostra. Introduza 321,54 e a leitura passará para 2,0000, com 1,00% de passagem. Um valor de 482,32 conduzirá a 3,0000 e 0,10%.

Cada um desses passos adiciona a mesma quantidade ao número no ecrã. O primeiro consumiu 90,00% do feixe incidente; o segundo levou mais 9,00% e o terceiro absorveu 0,90%. A linha Luz retida pela amostra apresenta o total acumulado correspondente a 90,00%, depois 99,00% e finalmente 99,90%.

Observe o local onde caem as linhas tracejadas na cuvete. Estas marcam a profundidade na qual cada unidade inteira de absorbância se acumulou. As linhas encontram-se uniformemente espaçadas porque a exponencial decai à mesma taxa em toda a célula. A luz é que não está distribuída de forma uniforme. Quando se atinge A = 3, é entregue ao detetor uma milésima parte da intensidade que entrou e pede-se-lhe que a meça bem.

A leitura mais precisa disponível é A = 0,4343, e não é a mais pálida

Um espectrofotómetro mede a transmitância. A sua incerteza fotométrica (tais como a resolução de leitura, o ruído do detetor ou o desvio da lâmpada) é aproximadamente um número fixo de unidades de transmitância, em vez de uma fração fixa da absorbância. Se aplicar essa premissa a A = −log₁₀T, a incerteza relativa na concentração resultará na expressão σT ÷ (T ln(1/T)).

Nem ε nem ℓ sobrevivem à divisão. Doze combinações diferentes de absortividade, concentração e comprimento óptico que calhem em A = 0,4343 produzem exatamente os mesmos 1,36% num instrumento com exatidão de 0,5 %T. A incerteza depende em exclusivo da leitura.

A expressão possui um máximo no seu denominador. T ln(1/T) atinge o valor mais elevado em T = 1/e, de modo que a melhor leitura se situa em A = log₁₀e = 0,4343 com 36,79% da luz a conseguir passar, sendo a incerteza correspondente igual a e·σT.

A faixa verde no painel de erro representa a zona onde uma leitura custa no máximo o dobro do limite inferior, cobrindo os valores de A desde 0,1007 até 1,1632. A curva sobe de ambos os lados do mínimo, exibindo um crescimento suave na parte inferior e de forma acentuada acima desta. Em A = 1 a penalização é de 1,60×, subindo para 7,99× em A = 2 e disparando para 53,26× quando A = 3. Recorrer a uma solução pálida também não serve de refúgio, pois a penalização já vai em 2,01× logo em A = 0,1.

A luz parasita impõe um teto à absorbância em 3,0004, e nenhuma química o consegue elevar

Parte da radiação da fonte atinge o detetor sem passar pela amostra. Esta pode dispersar-se na rede de difração, escapar por um espelho ou refletir-se no interior do monocromador. Chamemos s a essa fração. O que o instrumento reporta é então definido por −log₁₀[(10−A + s) ÷ (1 + s)]. À medida que a amostra escurece, a expressão para de subir e aproxima-se de log₁₀((1 + s)/s) sem avançar mais.

Prima Para além do limite. Uma solução milimolar de NADH tem uma absorbância verdadeira de 6,2200 e o instrumento reporta 3,0002. Falta mais de metade da absorbância. Esta página mostra os dois números em simultâneo porque os calculou analiticamente, mas um espectrofotómetro possui apenas o segundo valor e imprime-o de forma cega.

O atalho apresentado pela maior parte dos livros define Amax = −log₁₀ s, o qual coloca o teto em 3,0000. Os 0,0004 adicionais devem-se ao facto de o feixe de referência sofrer o mesmo efeito de fuga.

Os problemas começam a notar-se bem abaixo desse teto. Com 0,1% de luz parasita, a absorbância reportada fica 1% aquém em A = 1,5811 e 5% aquém em A = 2,5310, situando-se numa zona onde uma curva de calibração ainda pareceria convincentemente reta. Arraste o cursor de luz parasita e veja a linha vermelha mover-se ao longo do gráfico. Quando s sobe para 1% o teto desce até 2,0043, enquanto que uma redução para 0,01% eleva o limite até aos 4,0000.

Problema resolvido na íntegra

  1. Uma leitura de 2,49 e uma concentração com incerteza de ±107 9 passos

    Um ensaio enzimático é lido a 340 nm numa cuvete de 1 cm. O ecrã exibe 2,49 e o analista regista 400 µmol/L de NADH. A aritmética está correta. Descubra a fiabilidade desse número, identifique o que deveria ter sido feito em vez disso e verifique o que o instrumento estava de facto a reportar.

    Abrir este problema na ferramenta

    1. O NADH absorve radiação a 340 nm com uma absortividade molar de 6.220 L mol⁻¹ cm⁻¹. A concentração de 400 µmol/L corresponde a 4,0000 × 10⁻⁴ mol/L no interior de uma célula com 1 cm de largura. Isto resume a totalidade da lei e a ferramenta imprime o produto final sob Absorbância A.

      A=εcℓ=6220 L mol−1cm−1⋅4.0000×10−4 mol L−1⋅1 cm=2.4880A=\varepsilon c\ell =6220\ \mathrm{L\,mol^{-1}cm^{-1}}\cdot 4{.}0000\times10^{-4}\ \mathrm{mol\,L^{-1}} \cdot 1\ \mathrm{cm}=2{.}4880

    2. A absorbância define-se como −log₁₀T, pelo que será necessário inverter o seu valor. Verifica-se que cerca de três fotões num milhar saem da cuvete, o que significa que tudo aquilo que o analista se prepara para afirmar baseia-se na capacidade de o instrumento distinguir esse valor face a dois num milhar ou a quatro fotões num milhar.

      T=10−A=10−2.4880=3.2509×10−3=0.33%T=10^{-A}=10^{-2{.}4880}=3{.}2509\times10^{-3}=0{.}33\%

    3. Iremos agora atribuir-lhe uma incerteza. Como o instrumento mede T, pode-se escrever c em função de T e derivar a expressão. O ε e o ℓ aparecem tanto na derivada como na própria concentração acabando por se anular mutuamente. A incerteza relativa passa a depender exclusivamente da leitura.

      c=−log⁡10Tεℓ ⟹ dcdT=−1εℓ Tln⁡10 ⟹ σcc=σTεℓ Tln⁡10⋅εℓln⁡10ln⁡(1/T)=σTTln⁡(1/T)c=\frac{-\log_{10}T}{\varepsilon\ell} \ \Longrightarrow\ \frac{dc}{dT}=\frac{-1}{\varepsilon\ell\,T\ln 10} \ \Longrightarrow\ \frac{\sigma_c}{c} =\frac{\sigma_T}{\varepsilon\ell\,T\ln 10}\cdot\frac{\varepsilon\ell\ln 10}{\ln(1/T)} =\frac{\sigma_T}{T\ln(1/T)}

    4. Um instrumento de bancada decente garante uma precisão a rondar os 0,5% da escala de transmitância, fixando σT = 0,005. Ao reescrever a expressão em função de A em vez de T consegue-se utilizar o número que o primeiro passo já produziu. A ferramenta apresenta 26,85% sob Incerteza na concentração, concluindo-se que a resposta será de 400 µmol/L com uma margem de mais ou menos 107.

      σcc=σT 10AAln⁡10=0.005⋅307.615.72883=0.26845400⋅0.26845=107 μmol L−1\frac{\sigma_c}{c}=\frac{\sigma_T\,10^{A}}{A\ln 10} =\frac{0{.}005\cdot 307{.}61}{5{.}72883}=0{.}26845 \qquad 400\cdot 0{.}26845=107\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}}

    5. Onde é que o valor teria sido o mais pequeno? Pretendemos maximizar o denominador T ln(1/T), que possui um único máximo no qual a derivação resulta em −ln T − 1 e anula-se em T = 1/e. A melhor leitura disponível fixa-se em A = log₁₀e = 0,4343 acompanhada de uma incerteza correspondente a e·σT = 1,36%. A leitura do analista teve um custo 19,75 vezes superior a esse valor.

      ddT(−Tln⁡T)=−ln⁡T−1=0 ⟹ T=1e=0.36788,A=log⁡10e=0.4343,e σT=0.0135910.268450.013591=19.75\frac{d}{dT}\bigl(-T\ln T\bigr)=-\ln T-1=0 \ \Longrightarrow\ T=\tfrac{1}{e}=0{.}36788,\quad A=\log_{10}e=0{.}4343, \quad e\,\sigma_T=0{.}013591 \qquad \frac{0{.}26845}{0{.}013591}=19{.}75

    6. Uma leitura demasiado pálida custa 2,01× em A = 0,1 enquanto que uma leitura demasiado escura custa 53,26× em A = 3. Estas duas leituras encontram-se a uma distância comparável do ponto ideal, mas apresentam níveis de exatidão completamente díspares. É por esse motivo que o painel de erro está desenhado num eixo logarítmico e que se aconselha normalmente os laboratórios a diluir em vez de concentrarem as amostras.

      ATσc/c× floor0.100079.43%2.73%2.010.200063.10%1.72%1.270.434336.79%1.36%1.000.700019.95%1.55%1.141.000010.00%2.17%1.601.50003.16%4.58%3.372.00001.00%10.86%7.992.48800.33%26.85%19.753.00000.10%72.38%53.26\begin{array}{r|rrr} A & T & \sigma_c/c & \times\ \text{floor} \\\\ \hline 0{.}1000 & 79{.}43\% & 2{.}73\% & 2{.}01 \\\\ 0{.}2000 & 63{.}10\% & 1{.}72\% & 1{.}27 \\\\ 0{.}4343 & 36{.}79\% & 1{.}36\% & 1{.}00 \\\\ 0{.}7000 & 19{.}95\% & 1{.}55\% & 1{.}14 \\\\ 1{.}0000 & 10{.}00\% & 2{.}17\% & 1{.}60 \\\\ 1{.}5000 & 3{.}16\% & 4{.}58\% & 3{.}37 \\\\ 2{.}0000 & 1{.}00\% & 10{.}86\% & 7{.}99 \\\\ 2{.}4880 & 0{.}33\% & 26{.}85\% & 19{.}75 \\\\ 3{.}0000 & 0{.}10\% & 72{.}38\% & 53{.}26 \end{array}

    7. Proceda então à diluição. O cálculo 2,4880 ÷ 0,4343 = 5,73 reduz a amostra para 69,82 µmol/L, sendo este o valor que surge sob Concentração no ponto ideal. Bastou um passo de pipetagem para que o mesmo instrumento respondesse de forma 19,75 vezes mais precisa. A diluição acarreta uma incerteza própria que se adiciona em quadratura, e teria de ser pior do que 26,8% para que não valesse a pena fazer a troca.

      Alog⁡10e=2.48800.4343=5.73,copt=log⁡10eεℓ=0.43436220=6.982×10−5 mol L−1=69.82 μmol L−10.268452−0.0135912=0.268\frac{A}{\log_{10}e}=\frac{2{.}4880}{0{.}4343}=5{.}73, \qquad c_{\text{opt}}=\frac{\log_{10}e}{\varepsilon\ell}=\frac{0{.}4343}{6220} =6{.}982\times10^{-5}\ \mathrm{mol\,L^{-1}}=69{.}82\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}} \qquad \sqrt{0{.}26845^{2}-0{.}013591^{2}}=0{.}268

    8. No entanto, nada disto foi aquilo que o ecrã indicou. O instrumento reportou 2,3720 face aos 0,1% de luz parasita, um valor que fica 4,7% aquém da absorbância que a química produziu. O equipamento seria incapaz de reportar acima de 3,0004 independentemente daquilo que entrasse na cuvete. O valor de 2,49 registado pelo analista acumulava dois erros profundos antes mesmo de a incerteza ter sido quantificada.

      Ameas=−log⁡1010−A+s1+s=−log⁡103.2509×10−3+0.0011.001=2.3720,1−2.37202.4880=4.7%,Amax⁡=log⁡101.0010.001=3.0004A_{\text{meas}}=-\log_{10}\frac{10^{-A}+s}{1+s} =-\log_{10}\frac{3{.}2509\times10^{-3}+0{.}001}{1{.}001}=2{.}3720, \qquad 1-\frac{2{.}3720}{2{.}4880}=4{.}7\%, \qquad A_{\max}=\log_{10}\frac{1{.}001}{0{.}001}=3{.}0004

    9. O monocromador não fornece um único comprimento de onda e convém supor que metade do feixe incide onde ε é 20% mais baixo, algo típico em fendas de largura finita no flanco de um pico de absorção. O detetor soma as duas intensidades antes de o logaritmo ser calculado uma única vez no final, fazendo com que a absorbância aparente caia abaixo da média ponderada. Num A nominal de 1 o instrumento lê 0,8886 perante uma média de 0,9000; para um valor nominal de 2, a leitura será de 1,7555 perante 1,8000. O défice cresce com a concentração e a linha de calibração passa a curvar-se em direção ao eixo da concentração em vez de se deslocar de forma paralela. Se ancorar uma calibração de ponto único no valor ideal e a utilizar em A = 3, a concentração surgirá 3,03% abaixo da realidade. Estes fenómenos não constam no painel acima, visto que um segundo ε e uma divisão de feixe exigiriam mais três controlos do que os atualmente disponíveis nesta página.

      Aapp=−log⁡10[1210−A+1210−0.8A]:A=1→0.8886 (mean 0.9000),A=2→1.7555 (mean 1.8000)A_{\text{app}}=-\log_{10}\Bigl[\tfrac12 10^{-A}+\tfrac12 10^{-0{.}8A}\Bigr]: \quad A=1\to 0{.}8886\ (\text{mean } 0{.}9000), \quad A=2\to 1{.}7555\ (\text{mean } 1{.}8000)

    Resposta

    O valor é de 400 µmol/L mais ou menos 107. A aritmética estava certa mas a leitura encontrava-se no lugar errado: 0,33% do feixe passava através da célula e atribuía 26,85% à concentração. A incerteza foi 19,75 vezes superior àquela que o mesmo instrumento teria fornecido em A = 0,4343.

    Diluir 5,73× para 69,82 µmol/L fornece 69,82 ± 0,95, que se multiplicará de volta para os 400 ± 5,4. Tudo isto feito com a mesma amostra e o mesmo equipamento.

    De salientar ainda que os 2,4880 nunca chegaram a estar no ecrã. A luz parasita tinha consumido 4,7% desse valor antes sequer de o analista ter procedido a qualquer leitura.

    σcc=σTTln⁡(1/T)minimised atT=1e⟹A=log⁡10e=0.4343\frac{\sigma_c}{c}=\frac{\sigma_T}{T\ln(1/T)} \quad\text{minimised at}\quad T=\frac{1}{e} \quad\Longrightarrow\quad A=\log_{10}e=0{.}4343
Referências (5)

· Verificado com fontes publicadas. Correções bem-vindas.